项英等人并不是不知道第三战区这时已经在为限期以武力驱赶新四军军部北渡进行军事部署。这显然也是他们匆忙于4日出动南下的重要原因。因为他们明显地寄希望于三溪镇一带国民党军尚未完成其围堵线。
即使知道上官云相正在将第四十师调来，他们也还是相信，突破一个刚刚设防上来、尚未完成防御体系的第四十师的防线，到底比原地北渡或直接东去苏南，而与第五十二师和第一0八师作战，安全系数要大得多。
项英在确定行动路线后当天给中共中央的电报称：“我们决定全部移苏南，乘其布置未完即突进，并采取游击作战姿态运动，发生战斗可能性很大，我们如遇阻击即用战斗消灭之，遇张敌则采取游击绕圈，至万不得已时分散游击。”项英并具体说明了他们的意图。
对于此一行动方向和计划，中共中央于1月3日，即皖南部队开始北移的前一天，给予了明确的肯定，称：“你们全部坚决开苏南并立即行动，是完全正确的。”
新四军军部4日离开云岭后，即浩浩荡荡经湾滩、章家渡渡河，向茂林集结。国民党第四十师方日英部受命于12月27日交出溧阳、宜兴一带防务后，师主力于1941年1月2日午后抵达三溪镇附近，并开始构筑工事。
1941年1月6日，第三十二集团军发布命令，令左翼军以主力于次日向茂林、铜山徐方向攻击，并以一部守备章家渡方向；令右翼军以主力展开于后山、湾滩、李庄、东流山之线，于次日向茂林方向攻击。
7日，战斗打响。这时的新四军虽有1万人左右，但非战斗人员较多。而国民党军参战部队却有8个师的番号，实际达五六个师的兵力之多。因此，战斗展开后不久，面对四面八方涌来的国民党军，新四军就处于极端被动的状态，渐无还手之力了。战斗进行到9日，新四军大部已被打散。
随后，项英等擅自脱离部队，部队更加混乱，在各处山林中各自为战。至14日下午4时，叶挺在鹿角山以西山冲中被俘获。当天战斗全部结束。除傅秋涛率一部及早突围外，项英等被叛徒所杀，政治部主任袁国平19日死于国民党军的“清剿”中，整个新四军军部有7000余人战死或者被俘。
从上述情况可知，皖南事变的发生，并非第三战区，或负责围堵的第三十二集团军，预先针对新四军军部南进茂林，而在茂林以南山林设好陷阱，一网打尽。实际上，直到6日新四军与刚刚到达三溪镇的国民党军四十师的搜索部队遭遇后，第三战区才得知新四军南下的确切消息。
而根据台北保存的大溪档案和《徐永昌日记》，可知蒋介石及国民党军令部得到皖南冲突的正式报告，已经又是两天之后的事情了。顾祝同在6日晚发布命令，7日战斗打响，8日上午整个战场情况清楚后才通过电话正式报告蒋介石及军令部部长徐永昌，说明新四军不遵指定路线北渡。
据此，蒋介石9日才得以开始和白崇禧等具体讨论应付办法，并决定要“积极肃清”。而其做出此种决定的一个重要前提，仍旧是因为他相信：纵使有战事发生，亦不致造成两党关系全面破裂，因“中共决不敢在此时有所叛乱也”。
自8日顾祝同来电话后，第三战区不断有捷报传来，重庆军事高层中许多人兴高采烈，白崇禧等因此极力主张扩大战果，乘势向陕北、华中、乃至华北等地的八路军、新四军全面“进剿”。但这显然不符合蒋介石的想法，他明确地表示不同的意见。直到顾祝同随后来电说明已全歼新四军军部，俘虏军长叶挺等之后，蒋才不再有其他表示。
在军委会开会时，蒋对善后处置的态度仍与多数与会者的强硬态度不尽相同。与会者这时均赞同白崇禧的意见，主张“取消该军番号，叶挺交军法审判”，蒋却因顾虑中共的反应而相当犹豫。以后又经过一整天的反复斟酌，到16日晚蒋才最终下定决心，同意照白崇禧的意见行事。
1月17日，国民党以军委会发言人的名义，宣布新四军“违反军纪，不遵调遣，且袭击前方抗战各部队，实行叛变”，故撤销新四军番号，将新四军军长叶挺交军法审判。
由此可知，蒋此时确对事变缺少准备，并清楚地知道此举有可能破裂两党关系，他虽不得不追认结果，表现强硬，内心里却并不想扩大事态。但对此说，毛泽东自然不会相信，还在皖南事变前，中共中央就已经对强硬地推行限共政策的蒋介石和国民党颇多怀疑。
但基于抗日大局，中共中央对蒋的国内政策，还没有往最严重的方面考虑。正是由于一直相信只要蒋未与日本妥协，国民党在抗战中就不会主动破裂两党关系，突然发生皖南事变这样的惨剧，对毛泽东刺激之大亦可想而知。
新四军选择南下，事先显然曾报请中共中央批准。部队秘密潜往茂林次日，也曾向中共中央通报过具体位置，而后即失去联络。11日经中原局接通电讯后，国民党第三战区的聚歼计划已部署完毕，次日即发起总攻，新四军无论粮弹和地形均已难以坚持抵抗。
鉴于此，中共中央迅速于12日电告重庆的周恩来，要其向国民党提出严正交涉，即日撤围，以证明国民党并非有意破裂。中原局刘少奇等也曾气愤地致电中共中央，提议包围韩德勤，以与国民党交换。毛泽东显然认为这是解围皖南新四军一个可行的办法，故13日即复电刘少奇等，同意苏北准备包围韩德勤，山东准备包围沈鸿烈，限十天内准备完毕，待命攻击。
13日当天，周恩来、叶剑英紧急通过张冲等人向蒋介石进行交涉，而蒋的态度也很明确，表示新四军北开中央决不留难。但至14日，已有消息称：“上官云相十三日未时解决我七千余人，另有千余人已命坚决解决。”
15日晨，周恩来再次找张冲催问停火令事，张以电话向蒋报告，蒋答复称：12、13日已有两令给顾，或许下达迟延，但顾不会不听命。周可电告叶、项放心东进，他可再发一电给顾要他停战解围。但周这时已得知上官云相和何应钦关于皖南战况的电报内容，知道国民党军并未停止作战，因而愤然电告毛称：“恐蒋等所说的是鬼话。”