叶挺和项英致电中共中央，表示，“皖南部队开动需相当时间”，要求中央同意目前“暂留皖南”，同时积极部署北移之事。一天之后，毛泽东、朱德、王稼祥致电叶挺、项英，语气和措辞已经没有商量的余地：（一）你们必须准备于十二月底全部开动完毕。（二）希夷率一部分须立即出发。（三）一切问题须于二十天内处理完毕。同一天，毛泽东、朱德、王稼祥再次致电叶挺、项英：“立即开始分批转移，否则一有战斗发生，非战斗人员及资财势必被打散。”延安方面之所以一再催促，是因为有关皖南方向的所有情报均显示，十二月底之前各路国民党军将完成对新四军的合围。
十二月九日，蒋介石发出最后通牒式的命令：长江以南之新四军，全部限于本年十二月三十一日开到长江以北地区，明年一月三十日以前开到黄河以北地区作战。现在黄河以南之第十八集团军所有部队，限本年十二月三十一日止，开到黄河以北地区。距离蒋介石的最后时限，已经没有多少时间了。
新四军皖南部队，包括军部、一个教导团、一个特务团以及第一、第二、第三纵队各两个团，总计九千余人。国民党方面给新四军北移规定了一条路线：出新四军军部所在地皖南云岭后，向东偏北方向，沿着马头镇、杨柳铺、孙家埠、毕家桥、郎溪、梅渚镇、南渡镇，进入江苏南部的竹箦桥、水西地区，然后北渡长江到达苏北。这条路线，要通过第三战区第五十二师的防区。
为防止意外，新四军制订了一旦受到攻击就深入日军占领区的策略，因为国民党军是不敢往那里追击的。但是，十二月十日，蒋介石突然命令改变北移长江。这是一条陌生的路线，也是一条危险的路线。 事实证明，皖南的新四军正在走向一个巨大的陷阱。在蒋介石发出最后通牒式命令的同时，顾祝同调集了七个师八万人的兵力，任命第三十二集团军总司令上官云相为“前敌总指挥”，准备在新四军渡江后的移动路线上对其实施堵截和袭击。
二十九日，上官云相确定了围歼新四军的作战部署：以第五十二、第一o八师为右翼，在南陵、泾县、永济桥、丁家渡一线展开；以第四十、第一四四师和新编第七师为左翼，在茂林、包村、钱家桥一线展开，构成以云岭为中心的东、南、西三面包围，然后齐头向北推进，把新四军皖南部队压缩至长江边，予以歼灭。同时，第七十九师在太平、第六十二师在三溪镇附近形成防线，阻止新四军皖南部队向南撤退；第八十八军、忠义救国军和第二游击区部队布防郎溪地区，阻止新四军皖南部队东进。以上部署限于十二月三十一日前秘密完成。
新四军开始移动了。年轻的官兵不会想到无情的袭击来得突然而短促。此时，无论是从皖南北渡长江，还是从苏南北渡长江，都已是万分危险了。新四军北移的消息被国民党方面故意宣传出去，皖南铜陵与繁昌之间的日军已在江北据点增兵，而苏南的日军严密封锁了公路和铁路。特别是国民党军李品仙部的三个师，进驻庐江和无为一线，控制了铜陵与繁昌之间的长江北岸，挡在了新四军的北移之路上。
大雨滂沱，山路泥泞。新四军皖南部队九千余人编成三个纵队，由驻地云岭一带艰难地向东南方向行进，准备经过茂林、三溪、宁国和郎溪，沿着天日山麓进至苏南根据地，在那里待机北渡长江。一九四一年一月七日拂晓时分，走到皖南泾县茂林地区的新四军部队，突然遭遇国民党军第四十师的拦截。军部立即停下来开会，讨论还手还是不还手、前进还是后撤的问题。
会议从下午三时一直开到晚上十时，还是没有形成统一意见。长达七个小时的会议严重地耽误了时间，丧失了突围而出的最后时机。八日，部队改向前进，再次遭遇国民党军第七十九师的拦截。于是，改向茂林方向突围。此时，国民党军第五十二师、第一四四师、第四十师、第七十九师、第-O八师共五个师已完成了对新四军的合围。军长叶挺指挥部队顽强抵抗，激战一天，部队移至茂林以东五公里的石井坑。在整顿队伍的时候，国民党军合围部队又从四面发起猛攻，新四军官兵陷于苦战。
十日，叶挺、项英致电毛泽东、朱德：我全军被围于泾县茂林以南，准备固守，可支持一星期。请以党中央及恩来名义，速向蒋、顾交涉，以不惜全面破裂威胁，要顾撤围，或可挽救。上下一致，决打到最后一人一枪，我等不足惜。一周后若无转机，则将全军覆没……
身在重庆的周恩来获悉新四军陷入国民党军的重围后，受中共中央委托向蒋介石、何应钦、白崇禧、顾祝同提出严重抗议。周恩来致信蒋介石，要求国民党军“立即撤围”，给北渡长江的新四军让路，说否则新四军渡江无路，后退无援，将导致全军覆没的灾难性后果。蒋介石答复说将下令查处攻击新四军的将领，但同时又命令顾祝同把新四军一网打尽。
十三日，朱德、彭德怀、叶挺、项英等人联名发布抗议通电。通电的抬头从蒋介石一直开列到全国各地的国民政府党政军首脑。十四日，经过八昼夜的抵抗，新四军皖南部队弹尽粮绝，固守阵地全部被国民党军占领。政治部主任袁国平战死，副军长项英和参谋长周子昆被叛徒杀害，军长叶挺前去与国民党军上官云相谈判时被扣押，部队除突围而出的两千余人外，七千余人少量被俘大部阵亡。
十七日，蒋介石以国民政府军事委员会的名义，宣布新四军为“叛变”之军，决定撤销新四军番号，将军长叶挺交军事法庭审判。同时，命令李仙洲的二十万大军向长江以北的新四军发动全面进攻。十八日，中共中央发布《关于皖南事变的指示》，言皖南事变“是抗战以来国共两党之间，也是抗日民族统一战线内部空前的重大事变，应该引起全党及全国人民的注意。“ 。
二十日，中共中央政治局召开会议，决定以中共中央革命军事委员会的名义，发布重组新四军军部的命令。同日，这一命令在延安发布：任命陈毅为代理军长、刘少奇为政治委员、张云逸为副军长、赖传珠为参谋长、邓子恢为政治部主任。二十五日，新四军军部在湖北盐城重新设立。皖南事变发生后，全国的舆论乃至海外华侨的谴责铺天盖地。