在鄂豫皖省委的领导下，红二十五军根据花山寨会议的决定，立即进行战略转移准备。1934年11月13日，红二十五军在罗山县殷家湾、何家冲一带进行整编，撤销师一级建制，军直辖第二二三、第二二四团、第二二五团和手枪团，全军共2980余人。军长程子华，政委吴焕先，徐海东主动改任副军长，政治部主任戴季英。省委秘书长郑位三。
1934年11月16日，红二十五军在中共鄂豫皖省委的率领下，由罗山县何家冲出发，并发布《中国工农红军北上抗日第二先遣队出发宣言》，告别鄂豫皖根据地，踏上战略转移的征途。1934年11月17日，红二十五军在罗山朱堂店以南的罗古寨击退国民党“追剿纵队”第五支队的进攻，当晚在信阳以南的东双河与柳林之间，越过了平汉铁路，急行进入桐柏县境内，并经鸿仪河向南，翻越太白顶，到达湖北界牌口一带。11月19日，红二十五军进入桐柏山区，迈出了实施战略转移、北上抗日的第一步。
蒋介石知悉红军进入桐柏山区后，急令“豫鄂皖三省剿匪总司令部”副总司令张学良派出“追剿队”五个支队和东北军第一一五师追击，同时命令驻河南南阳一带的庞炳勋第四十军和驻湖北老河口一带的萧之楚第四十四师堵截。当红二十五军到达湖北界牌口一带时，经过实地考察和中共鄂豫边工委的介绍，省委认为这里距离平汉铁路和汉水很近，回旋范围小，敌又重兵追堵，难以立足发展，于是决定迅速掉头北上，跳出敌人合围，向伏牛山挺进。
11月26日，红二十五军在河南方城独树镇遭国民党第四十军一一五旅和骑兵团的堵截。经过一番恶战，红军终于打退敌军的进攻，突出重围。独树镇战斗是红二十五军在战略转移途中一次极为险恶的战斗。11月28日，西进至拐河镇东北的孤石滩，正准备渡澧河时，遭到敌军的袭击。在副军长徐海东、政委吴焕先指挥下，分两路渡河，在果木庄、交界岭击退敌军，经由神林、熊背、下汤等地西入伏牛山区。
伏牛山，从地势上看，具有得天独厚的战略优势，中共鄂豫皖省委和红二十五军原打算在此创建根据地，但入山后发现，该山区人烟稀少、物资匮乏，群众长期与世隔绝，不利于红军开展群众工作。此外，又有敌第四十军和“追剿队”追击，一时站不住脚。省委经过研究，决定改变原有计划，继续西行，准备在陕南相机创建新的根据地。
1934年11月30日，红二十五军以“中国工农红军北上抗日第二先遣队”司令部、政治部名义发出布告，明确指出红军入陕是为了北上抗日。颁发布告后，红二十五军日夜兼程，向豫陕边界前进。1934年12月8日，红二十五军先头部队从兰草村直达铁锁关，击溃守关民团，掩护主力顺利进入陕南。这时，陕军第四十二师两个团已进到雒南县城及三要司一带，红军以第二二五团实施正面攻击，其余部队迂回到高地西侧攻击敌人，歼灭陕军第四十二师二四八团一个营。次日，红二十五军进入雒南庾家河（今属陕西省丹凤县）。
1934年12月10日上午，省委在庾家河召开第十八次常委会议，会议决定在以陕南为中心的鄂豫陕边区创造新的革命根据地。会议期间，突遭国民党第六十师三个团袭击。红二十五军排哨发现时，敌先头部队已夺占有利地形，向红军发起猛烈进攻。程子华、吴焕先、徐海东等率领红军战士进行反击。徐海东率领二二三团冒死冲锋，夺回东山坳口。激战中，徐海东被子弹击中昏了过去，程子华也受了重伤，军政委吴焕先指挥作战，经过20多个回合激战，最终将敌军击垮。
庾家河反击战，共毙伤敌军300余人，而红二十五军却也付出了伤亡100余人的代价。庾家河反击战，是红二十五军入陕后的一场殊死的反击战，它结束了红二十五军历时20余天，长驱1800余里，挺进陕南的战斗历程，为打开陕南的革命局面奠定了军事和政治基础。此外，还调动了国民党军队“围剿”鄂豫皖根据地的大部分兵力，配合了红二十八军坚持鄂豫皖根据地的斗争。从此，红二十五军进入创建鄂豫陕根据地的阶段。
1934年12月11日，红二十五军到达雒南蔡川。鄂豫陕省委决定在蔡川进行整编：将第二二四团编入第二二三、第二二五团；程子华、徐海东、吴焕先军内职务不变，原军政治部主任戴季英改任军参谋长，原省委秘书长郑位三任政治部主任。整编后红二十五军下辖三个团：第二二三团、二二五团、手枪团，共2500余人。
红二十五军入陕五个月以来，彻底摆脱了围追的河南敌军，击溃了警二旅、警三旅等大部分陕军兵力，攻占镇安、柞水、宁陕、佛坪、雒南五座城池，主力扩大至3700余人，地方游击师、抗捐军2000多人，并成立了中共鄂陕边、豫陕边两特委和多个县工委，先后成立了鄂陕边苏维埃政府和多个县区乡苏维埃政权，开辟了鄂豫陕苏区，人口达50万人。在南方大部分根据地陷落的情况下，一个新的苏区出现在北方，它与川陕、陕甘根据地互为犄角，推动了北方苏维埃革命的继续发展。
红二十五军离开鄂豫皖根据地后独立行动，对国内外形势和各路红军行动方向知之甚少。在威逼西安行动中，从《大公报》上得知中央红军和红四方面军已在川西北会合，并有北上动向。省委根据获得的消息，立即于1935年7月15日在长安沣峪口召开紧急会议。会议决定继续西征北上，配合红军主力。会议还决定合并鄂陕、豫陕两特委，组成鄂豫陕特委，由李隆贵、郑位三、陈先瑞领导地方武装继续坚持鄂豫陕根据地斗争。
7月16日，红二十五军从沣峪口地区出发，经?县（今户县）、周至沿秦岭北向汉中方向前进，再次踏上长征路。7月30日，红二十五军从江口镇出发转向西北。8月3日，攻占甘肃两当县城，翻越麦积山，9日攻占天水城北关。8月11日，红二十五军从新阳镇北渡渭河，进点秦安县城北进，14日威逼静宁县城，拦腰截断了陕甘两省的交通要道西（安）兰（州）公路，打乱了敌人的部署，减轻了中央红军的正面压力。
为与中央红军取得联系，1935年8月17日，红二十五军从兴隆镇出发，沿西兰公路东进，一举攻克隆德城，后又连夜翻越六盘山，直逼平凉城。平凉守敌为国民党第三十五师第一0四旅一个营，属于马鸿宾防区。为堵截红二十五军北上，马鸿宾将兵力布防于陇东的西兰公路沿线。在与马鸿宾部战斗中，军政委吴焕先不幸中弹，壮烈牺牲。由于吴焕先牺牲，程子华负伤，由徐海东代理军政委和省委书记。蒋介石这时调动大量兵力，逐渐向红二十五军形成合围之势。省委和军部立即召开会议，决定继续北上，与陕甘红军会合。
9月7日，红二十五军抵达陕甘根据地合水豹子川（今属华池县）。省委在这里召开了会议，会议决定程子华代理中共鄂豫陕省委书记，并兼任军政治委员，任命徐海东为红二十五军军长，戴季英为参谋长，郭述申为政治部主任。1935年9月9日，红二十五军进抵保安县（今志丹县）永宁山，并与陕甘党组织取得了联系。中共陕甘边特委、军委知悉红二十五军已抵达永宁山后，迅速向中共西北工委报告，习仲勋、刘景范等人亲自到永宁山迎接红二十五军。
1935年9月15日，红二十五军全军上下约3400人到达陕西省延川县永平镇，胜利结束长征。16日，同红二十六、红二十七军胜利会师，举行了盛大的军民联欢会。之后合编为红十五军团，徐海东任军团长，刘志丹任副军团长兼参谋长，程子华任政委。
红二十五军撤离鄂豫皖根据地时，留下的红二十八军，英勇坚持了三年游击战争。抗日战争开始后，这支三千人的武装编为新四军第四支队。撤离鄂豫陕根据地时，留下的武装组建为红七十四师，同样坚持了鄂豫陕边的游击战争，这支两千多人的队伍，随后奉命改编为八路军一一五师留守处，不久改为西北留守兵团警备第四团。